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浅谈色谱积分方法

开发技术 开发技术 3小时前 2次浏览

色谱积分方法,最近几年控制的比较严格,官方审计的时候甚至有要求将积分方法固定在sop中,任何的积分方法修改都要经过批准。本文我们来探讨积分的那些事吧。

一、定义

1.积分

指在信号中确定峰并计算其大小,积分包括以下操作及步骤:识别、校正、定量。

2.积分事件的参数控制

对于某个信号进行积分时,软件将识别每个峰的开始和结束时间,并用竖线标记这些点,寻找每个峰的峰顶点,确定保留时间/迁移时间,建立基线,以及计算每个峰的峰面积、峰高和峰宽。这些过程积分事件的参数控制。

3.自动积分

自动积分功能为设置初始事件提供开始点。自动积分功能设置以下参数初始斜率灵敏度(阈值)初始峰高初始峰宽初始最小峰面积

4.手动积分

此类型的积分允许对选定的峰或峰组进行积分,在指定的手动积分范围内,将忽略此软件的事件积分(初始最小峰面积除外)。如果手动积分出来的一个或多个峰低于最小峰面积阈值,则此积分将被废弃。
手动积分提供以下功能:
划基线:指定为一个峰或一组峰划基线的位置;
负峰:指定何时将基线以下的面积当作负峰处理;
切线撇去:计算从主峰切线撇去的峰面积
分列峰:指定用垂线分裂峰的点
删除峰:从积分结果中删除一个或多个峰。

二、积分参数
无论是Agilent液相还是waters液相,自动积分主要是修改以下4个积分参数实现的,具体如下:

  1. 斜率灵敏度(Slope Sensitivity)
    也称阈值,指设置信号斜率的值,该斜率用于识别积分过程中峰的起点和终点。如果信号斜率大于”斜率灵敏度”值,将建立峰起点,如果信号斜率降到“斜率灵敏度”以下,将建立峰止点。

设置值越低,峰响应越灵敏,当然,不同品牌的仪器对设置值的响应程度会有所区别,一般情况下,岛津液相斜率灵敏度的修改对积分效果产生的影响较大,相对来说,Agilent和waters敏感度较低;
2. 峰宽值(Peak Width)
用于控制积分器的选择性以区分峰与基线噪音。如果设置的初始峰宽太小,则可能将噪音当作峰。如果峰宽与窄峰混在一起,可以选用运行时间编程事件设定特定的峰宽。
3. 最小峰面积(Area Reject)
根据峰面积来设置小于目标峰面积的峰不被积分也不会报告;
4. 最小峰高(Height Reject)
最小目标峰的高度,任何小于最小峰高的峰将不被积分及报告

三、积分原则

1.关于手动积分
能进行手动积分吗?答案是肯定的,可以进行手动积分,但手动积分必须在受控的情况下进行。一般情况下,应采用自动积分方式,不可以手动积分。特殊情况下,若是目标峰实在无法自动积分的,即对于采取高级积分的方式还不能将峰有效的积分,经申请与批准后,可以进行手动积分。此外必须严格控制手动积分次数,因为如果一套好的分析方法,峰与峰之间的分离较好,根本是不需要手动积分,手动积分的图谱,峰与峰的分离势必不好。
2.关于忽略限
如USP 621的最后章节规定:”When the impurity test prescribes the total of impurities or there is a quantitative determination of an impurity, choice ofan appropriate threshold setting and appropriate conditions for the integration of the peak areas is important. In such tests the limit at or below which apeak is disregarded is generally 0.05%. Thus, the threshold setting of the data collection system corresponds to at least half of this limit. Integrate the peak area of any impurity that is not completely separated from the principal peak, preferably by valley-to-valley extrapolation (tangential skim).”单个杂质及总杂质的定量测定,选择合适的阈值设置和合适的条件进行积分是很重要的。这种情况下,峰值可忽略通常设为0.05%。因此,数据采集系统的阈值设置至少相当于这个限制的一半(0.025%)。对任何未与主峰完全分离的杂质进行积分,最好采用峰谷对峰谷外推法(切向撇去法)。”
值得注意的是,USP621规定的报告阈是0.05%,但积分是(最小峰面积)设定应设为0.025%对应的峰面积。另外,对于与主峰未完全分离的杂质,USP建议的积分方法为切向撇去法,当然原料药之类的可以与客户沟通,统一积分方法,避免由于积分原因导致投诉。
3. 关于积分方法是否需要固定
积分方法是否需要固定?个人认为应该分情况,分析方法验证期间时积分参数摸索期,通过整套分析方法验证过程来确定积分参数,这期间没有修改积分参数之说,因为本身就没有积分方法。放行检测的积分方法可以现根据验证情况进行确定,之后所有检测的积分方法应该是固定的,任何修改积分参数的行为应该进行申请,批准后方可进行修改。
稳定性考察为了反映杂质的趋势,积分方法可以与放行的方法不同,但不同时间点的积分方法应该相同,任何修改,同样需要申请及批准。

  1. 积分方法的审计追踪
    目前的色谱系统,均有审计追踪,当我们对积分方法进行修改时,均会出现“comment”,要求输入具体的修改内容。有的公司采用数字代码的形式,例如:“1代表新建……”,总之,各位认为这种方法不是特别清晰修改了什么,还是如实的输入修改内容比较明确,对于英文输入的问题,个人认为可以将日常用到的常用的comment规定到文件中,分析人员可以参照文件输入正确的英文comment。

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